Fluoreszenzmikroskopie am KFG

KFG möchte mit Fluoreszenzmikroskopie begeistern

Im MINT-Bereich möchte man es oft sehr genau wissen.

von: Markus Möhring, StD i.K.
Stellv. Schulleiter

Im MINT-Bereich möchte man es oft sehr genau wissen. In der Mathematik, der Informatik, den Natur­wissenschaften Biologie, Chemie und Physik, sowie in der Technik versucht man u.a. über das Verständnis der kleinsten Struktur- und Funktionseinheiten die Erscheinungen in der Natur zu erklä­ren. Das Kardinal-Frings-Gymnasium fördert in besonderem Maße diese sog. MINT-Fächer.

In der Biologie weiß man seit langem, dass alle Lebewesen aus Zellen bestehen, die mikrosko­pisch klein sind. Es ist kein Zufall, dass der Beginn der modernen Naturwissenschaften historisch erkenn­bar mit der Erfindung des Lichtmikroskops zusammenfällt. Zellen vermehren sich durch Tei­lung. Dabei geben sie ihre Merkmale an die Tochterzellen weiter. Sie setzen Energie um und stellen Produkte her. Wie diese Prozesse im Inneren der Zellen ablaufen ist erst mit Hilfe moderner bildgeben­der Instrumente aufgeklärt worden. Das Lichtmikroskop ist in Schulen zu einem unverzichtba­ren Hilfsmittel geworden. Die Fachschaften des KFG in der Physik, Chemie und Biologie verfügen über eine außergewöhnlich gute Ausstattung, die den Schüler/innen das selbständige Experi­mentieren und Forschen ermöglicht, so auch in der Mikroskopie.

Göttinger Professor Dr. Stefan W. Hell erhielt 2014 fürdie sog. STED-Fluoreszenz-Mikroskopie den Chemie-Nobelpreis.

Die Entwicklung ist dort aber nicht stehen geblieben. Inzwischen gibt es z.B. Elektronen­mikro­skope, Laser Scanning Mikroskope und Röntgenmikroskope. Der Göttinger Professor Dr. Stefan W. Hell erhielt 2014 fürdie sog. STED-Fluoreszenz-Mikroskopie den Chemie-Nobelpreis.

Im “Internationalen Jahr des Lichts” 2015 freut sich das KFG sehr, dass es seinen Schüler/innen ein Highlight der Mikroskopie präsentieren kann. Ein Unternehmer, der ein sog. Fluoreszenz­mikro­skop in der Forschung und Entwicklung eingesetzt hatte, gab das Mikroskop nach Ablauf der Nutzungsdauer für gemeinnützige Zwecke frei. Er suchte eine Schule, welche aufgrund ihrer bisheri­gen Aktivitäten hinreichend qualifiziert war, die Begeisterung für Naturwissenschaft und Technik mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops zu wecken und weiter zu vertiefen. Die Wahl ist auf das KFG gefallen.

Firma Carl Zeiss Microscopy als starker Kooperationspartner

Mit der Firma Carl Zeiss Microscopy haben wir einen starken Kooperationspartner ge­wonnen, der uns externe Unterstützung bietet, um unsere Schüler/ in den naturwissenschaftlichen Fächern in Zukunft noch besser fördern zu können. Das KFG hofft, weitere externe Partner in Bonn und Umgebung gewinnen zu können, die uns in dieser Aufgabe unterstützen.

In diesem Schuljahr stehen wir mit dem Fluoreszenzmikroskop erst am Anfang. Zunächst möchten wir prüfen und aufzeigen, inwieweit der Einsatz im regulären Unterricht der Grund- und Leistungskurse möglich ist. Weiterhin soll das Mikroskop im Differen­zierungs­bereich der Mittelstufe eingesetzt werden. Durch den Einsatz des Fluoreszenzmikroskops können wir auf besondere Weise den Anforderungen in den neuen Kernlehrplänen gerecht werden. Diese sind heutzutage kompetenzorientiert, d.h. neben dem bekannten Erwerb und Umgang mit Fachwissen sollen den Schüler/innen u.a. auch die Wege des wissenschaftlichen Erkenntnisgewinns (beobachten, vergleichen, experimentieren ...) erschlossen werden. Die Abiturleistungen der Schüler/innen des KFG in Biologie sind deutlich über dem Landesdurchschnitt angesiedelt. In den letzten drei Jahren wurden neun Schüler/innen des KFG vom Landesverband Nordrhein-Westfalen im VBIO (Verband Biologie, Biowissenschaften und Biomedizin) mit dem Karl-von-Frisch-Preis für herausragende Schüler­leistungen im Fach Biologie ausgezeichnet.

Am 4.9.2015 haben sich der Schulleiter, Dr. Bernhard Hillen sowie als Vertreter des Schulträgers der Schulrat Alfred Schwanke bei Dr. Josten von der Firma Carl Zeiss Microscopy für die Koordination der Mikroskop-Spende und den geleisteten Support bedankt.

Informationen zum Mikroskop und zur Fluoreszenzmikroskopie

a) Das Mikroskop Axioskop 2 mot ist als universell einsetzbares Mikro­skop für Applikationen in der Biologie und in der Medizin unter anderem zur Untersuchung von Gewebeproben aus dem menschlichen Körper vorgesehen. Es kann als reines Durch­lichtmikroskop oder ausgestattet mit einer Auflicht-Fluoreszenz-Einrichtung als kombiniertes Durchlicht-/ Auflichtmikroskop eingesetzt werden. Es ist mit motorisierten Bedien- und Funktionsele­menten ausgestattet. Weiterhin besitzt es eine Kameraausstattung zur Direktmon­tage an einen Beamer sowie die AxioVision Software. Mit dieser digitalen Bildverarbeitungssoft­ware kann man alle Mikroskop-Einstellungen und Verarbeitungsschritte auf einer einzigen Benutzerober­fläche schnell und bequem einstellen. AxioVision erlaubt es, Bilder in verschiedenen Dimensionen darzustellen und zu präsentieren, z.B. als 3D-Bild. Mikroskop-Bilder werden als Z-Sta­pel aufgenommen; der dabei entstehende Bildstapel liefert wertvolle Informationen über die Beziehun­gen mikroskopischer Strukturen in axialer Richtung.

Stokes-Verschiebung

b) In der Fluoreszenzmikroskopie werden die Präparate mit speziellen Stoffen behandelt. Deren ein­zelne Moleküle sind in der Lage, Licht für eine sehr kurze Zeit aufzunehmen und dann wieder abzu­strahlen. Das abgestrahlte Licht hat aber eine etwas „in Richtung rot" verschobene Wellen­länge. Wird zum Beispiel blaues Licht absorbiert, so kommt es gleich darauf zur Emission von grü­nem Licht. Grün wird in Gelb umgewandelt, Gelb in Rot-orange und unsichtbares UV-Licht in sichtba­res Licht. Diese Verschiebung wird nach ihrem Entdecker als Stokes-Verschiebung bezeich­net.

Die Fluoreszenzmoleküle können nur Licht ganz bestimmter Wellenlänge absorbieren.

Die Fluoreszenzmoleküle können nur Licht ganz bestimmter Wellenlänge absorbieren. Die verschiede­nen Fluorophore zeigen ‒ jede Sorte für sich ‒ ganz bestimmte Absorptionsspektren, die vom inneren Aufbau der Fluoreszenzmoleküle und manchmal auch von ihrer Umgebung abhängen. Auch wird nicht jedes Photon absorbiert, sondern nur ein Teil des bestrahlenden Lichtes. Die eingefange­nen Photonen werden auch nicht alle wieder abgestrahlt: Gute Fluoreszenzmarker haben eine hohe „Quantenausbeute", womit man das Verhältnis der abgestrahlten zu den eingefangenen Photonen beschreibt.

Für die Mikroskopie ist dieser Effekt sehr nützlich: Man beleuchtet eine derart markierte Probe mit reinem, gefilterten blauen Licht und beobachtet sie mit Hilfe eines Sperrfilters, das für blaues Licht völlig undurchlässig ist, aber langwelliges grünes, gelbes und rotes Licht durchlässt. Dann leuch­ten die mit Fluoreszenzmolekülen markierten Strukturen ‒ zum Beispiel Teile eines Zellske­letts ‒ grün vor schwarzem Hintergrund.

In den Anfangstagen der Mikrofluoreszenz wurden die Präparate meist unspezifisch mit Fluoreszenz­farbstoff angefärbt. Diese Art der Markierung sieht zumeist hell aus, weil viele Fluoreszenz­moleküle überall gebunden werden. Heute sind die Fluoreszenzmethoden aber viel spezifi­scher geworden. Dies wird vor allem dadurch erreicht, dass die Fluoreszenzmoleküle mit biologi­schen Substanzen wie zum Beispiel speziell designten Antikörpern fest gekoppelt werden. Dann bestimmt nicht mehr der „Farbstoff" die Bindungsstelle, sondern das biologische aktive Antikörper-Molekül. Dies führt in der Regel zwar zu schwächeren Fluoreszenzbildern im Mikroskop ‒ weil viel weniger „Farbstoff" gebunden wird. Die Aussagen ‒ zum Beispiel bei der Diagnose von Krankheiten ‒ werden aber viel genauer.

Werden Zellen mit solchen Fluoreszenzmarkern behandelt, so lagern diese sich an bestimmten Struktu­ren an. Bei der Beleuchtung mit Anregungslicht leuchten die Fluoreszenzmarker auf und machen diese Strukturen durch ihr Emissionslicht sichtbar. Mit Hilfe von Kooperationspartnern ist es uns gelungen, solche Präparate zu erhalten.

Markus Möhring, StD i.K.
Stellv. Schulleiter

Workshop zur Bildverarbeitung im NW-Unterricht

Halbjahresthema „Information und Kommunikation“

von: Dr. Jörg Severin

 

Unter dem Halbjahresthema „Information und Kommunikation“ geht es im NW-Differenzierungs-Unterricht um die Erzeugung, Aufnahme und Verarbeitung akustischer, elektrischer und optischer Signale. Beim Differenzierungsunterricht in Naturwissenschaften (Stufen 8 und 9) soll das fächerübergreifende, experimentelle und projektorientierte Arbeiten im Vordergrund stehen. Dank einer Spende bzw. Leihgabe von zwei hochwertigen Fluoreszenz-Mikroskopen mit Personal-Computern und Auswertungssoftware konnten diese Ziele im Rahmen eines dreistündigen Workshops in idealer Weise umgesetzt werden.

Herr Dr. Josten von unserem Kooperationspartner ZEISS

Zum Einstieg stellte Herr Dr. Josten von unserem Kooperationspartner ZEISS in einer PowerPoint-Präsentation sehr anschaulich und gut verständlich vor, welche Probleme entstehen, wenn man aus einem Stapel von Schnittbildern die räumliche Lage biologischer Strukturen rekonstruieren möchte. Hierzu muss vorausgeschickt werden, dass für diese Form der Bildverarbeitung fluoreszierende Präparate und spezielle Mikroskope erforderlich sind. Mit den üblicherweise in der Schule eingesetzten Durchlicht-Mikroskopen lassen sich keine räumlichen Bilder erzeugen. Fluoreszenz-Mikroskope strahlen energiereiches Licht auf das Präparat. Innerhalb des Präparates sind interessierende Strukturen mit Antikörpern, an die ein fluoreszierender Farbstoff gekoppelt wurde, markiert worden. Die Farbstoffe nehmen das eingestrahlte Licht auf (Absorption) und strahlen energieärmeres Licht in alle Richtungen ab. Es entstehen innerhalb des Präparats Punkte, die in einer Farbe leuchten. Werden verschiedene Antikörper mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoffen verwendet, entstehen mehrfarbige Bilder. Beim Mikroskopieren stellt man jeweils eine Schnittebene des Präparates so ein, dass man die Details dieser Ebene scharf abbildet. Verändert man den Abstand zwischen Präparat und Objektiv, erscheinen die vorher gesehenen Strukturen unscharf (verschwommen) und Details einer anderen Schnittebene sind erkennbar. In jeder Schärfeebene beeinflussen die Strukturen oberhalb und unterhalb dieser Ebene die optische Abbildung. Diese Strukturen verändern den Weg des eingestrahlten und des durch Fluoreszenz abgegebenen Lichtes. Aufgrund der Welleneigenschaften des Lichtes treten Beugungen und Interferenzen (gegenseitige Verstärkungen bzw. Auslöschungen) auf. Hier konnte Herr Dr. Josten in seinem Vortrag auf das Vorwissen aus dem Kurshalbjahr 9.1 zurückgreifen. Im Rahmen des Kurses „Mikroskopie“ hatten die Schülerinnen und Schüler bereits kennengelernt, dass das Strahlenmodell des Lichtes an Grenzen stößt. So lässt sich die begrenzte Auflösung aller Mikroskope nur verstehen, wenn man das Licht als Welle, ähnlich einer Wasserwelle, betrachtet. Die durch die Welleneigenschaften des Lichtes bedingten Probleme bei der Bildverarbeitung lassen sich mit Hilfe eines mathematischen Verfahrens angehen. Die Rohdaten der einzelnen Schnittbilder werden einer sogenannten Dekonvolution unterzogen, um die beschriebenen Störungen herauszurechnen und zur tatsächlichen räumlichen Struktur des Objektes zu gelangen.  

 

Anwendung im praktischen Teil des Workshops

Im praktischen Teil des Workshops wurden die erworbenen Kenntnisse angewendet. Als Objekt wurde in Vorversuchen ein Präparat, in dem Zentromere mit fluoreszierenden Antikörpern markiert waren, ausgewählt. Zentromere sind die Regionen von Chromosomen, die die Schwesterchromatiden zusammenhalten und an denen die Spindelfasern bei der Kernteilung ansetzen. Dieses und andere Präparate zu Zellorganellen, die über Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden, wurden uns freundlicherweise von der Firma EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG zur Verfügung gestellt. Aufgeteilt in zwei Untergruppen konnten die Schülerinnen und Schüler unter Anleitung an den beiden Fluoreszenz-Mikroskopen arbeiten und dabei die Objektsuche, die Vergrößerungsschritte und dem Umgang mit der AXIOVISION-Software zur Steuerung und Auswertung lernen. Es wurden 50 Schnittbilder erzeugt und gespeichert.

Dieser Workshop wäre ohne zahlreiche Unterstützungen nicht möglich gewesen, Wir danken herzlich für die anonyme Spende bzw. Leihgabe der beiden Fluoreszenzmikroskope und die Bereitstellung der Software  sowie den Support durch die Firma ZEISS. Der Förderverein des KFG und der Schulträger haben dankenswerterweise die Computer und Bildschirme zu den Mikroskopen  finanziert. Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Josten von der Firma ZEISS für die hervorragende Betreuung unserer Schule und die wiederholte Durchführung von Workshops, die unsere Schülerinnen und Schüler für die Naturwissenschaft begeistern. 

Dr. Jörg Severin